假如你是刚进试验室的试验新手，师兄师姐比较忙，或许没办法每个试验细节都给你解说清楚，那么或许小赛新推出的

  假如你现已做了许多试验了，那试验干货系列推文或许能帮你查漏补缺，你也能够在留言区和小赛沟通你的试验经历哦~

  WB（Western Blot，蛋白免疫印迹）是一种惯例的蛋白剖析技能，常用于判定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量剖析。

  WB试验的根本核心理念是抗原抗体的特异性反响，经过变性胶 SDS-PAGE 将不同分子量的蛋白质分脱离，然后转移到固相载体 PVDF 膜上，再用脱脂牛奶作为关闭液进行关闭和一抗稀释液进行稀释。待意图蛋白和抗体充沛结合后，用 TBST 洗脱液洗脱掉剩余未结合的一抗，参加带有 HRP 符号的对应二抗，这样，咱们的蛋白+一抗+二抗构成一个复合物，加以化学发光液，有靶蛋白的方位就会发生荧光，使用胶片或许化学发光仪就能够闪现靶蛋白的条带闪现。

  WB惯例试验流程：蛋白提取→蛋白定量→制胶→电泳→转膜→关闭→一抗孵育→一抗洗脱→二抗孵育→二抗洗脱→化学发光→数据剖析。

  取电泳缓冲液干粉（G2018-1L），溶解于 1L纯水（G4701-500ML）中，置于磁力拌和器（MS-150）上拌和充沛溶解。

  取转膜缓冲液干粉（G2017-1L），溶解于 800mL 纯水中，参加 200mL 的甲醇，置于磁力拌和器上拌和充沛溶解。

  取TBS 粉剂（G0001-2L），溶解于 2L 纯水中，参加 1mL 吐温20，置于磁力拌和器上拌和充沛溶解。

  称量 5g脱脂奶粉（G5002-100G），溶解于 100mLTBST 溶液（G0004-500ML）中，置于磁力拌和器上拌和至少 30分钟，然后放入 4℃冰箱暂放。

  因为文章篇幅约束，小赛这次先介绍安排或细胞的蛋白提取和蛋白定量惯例流程。

  安排块先用预冷PBS洗刷 2-3 次，除掉血污，然后放在滤纸上，吸尽剩余的 PBS 后放入对应的匀浆管中，参加大约 10 倍样本体积的彻底裂解液，置于安排研磨仪（三维冷冻研磨仪KZ-5F-3D）中，对称放置，承认放置平衡后，盖好盖子，挑选程序开端匀浆。

  ①芝麻巨细的安排，一般参加100-200μL 彻底裂解液；绿豆巨细安排参加 400-600μL 彻底裂解液；黄豆巨细安排参加 800-1000μL彻底裂解液。

  ②Servicebio三维研磨仪参阅参数：2mm 氧化锆珠8-12颗，频率6.5m/s，时刻30s。假如一次匀浆不彻底，能再一次匀浆）。假如安排块比较大，可提早用剪刀将安排块剪碎。

  将细胞连带培育基一同吸入15mL 离心管（EP-1501-J）中，4℃，2000rpm，离心 5分钟，去掉上清；

  参加 1mLPBS 溶液（G4202-500ML）重悬细胞，将细胞转移到1.5mL 离心管（EP-150-M）中，然后 4℃，2000rpm，离心 5分钟，去掉上清，保存沉积，重复此过程 2-3 次（此过程意图为清洗细胞中残留的培育基）；

  依据细胞沉积的量参加适量的彻底裂解液，例如沉积体积为绿豆巨细（大约 10uL 左右）的参加大约 200μL 彻底裂解液，参加适量研磨珠，放入研磨仪进行裂解；

  裂解完成后，12000rpm，4℃，离心 10分钟，上清即为总蛋白溶液。

  倒掉培育基，沿细胞培育皿侧壁或许培育瓶瓶口渐渐参加 PBS 溶液，悄悄晃动平皿或许培育瓶，然后将细胞培育皿/瓶歪斜放置，用移液枪悄悄吸除剩余液体，尽量轻柔，不要将细胞冲掉，清洗 2-3 次，最终一次将剩余 PBS 彻底吸干；

  参加恰当体积的彻底裂解液（例如六孔板各单孔细胞长满的线μL彻底裂解液），重复晃动细胞培育皿/瓶，让裂解液与细胞彻底触摸，用细胞刮刀将细胞刮下来，搜集后，参加研磨珠，放入研磨仪中进行裂解；

  裂解完成后，12000rpm，4℃，离心 10分钟，上清即为总蛋白溶液。

  取适量上述过程中未变性的总蛋白溶液，用BCA 蛋白定量检测试剂盒（G2026-200T；G2026-1000T）测蛋白浓度，蛋白浓度测定办法如下：

  取1 mL蛋白规范制造液参加到蛋白规范品（BSA）蛋白规范管中，将25 mg蛋白规范品彻底溶解，即得到浓度为25 mg/mL的蛋白规范贮备液。制造成的蛋白规范溶液可-20℃长时刻保存。

  取适量25 mg/mL蛋白规范贮备液，用PBS或生理盐水稀释50倍，得到终浓度为0.5 mg/mL的蛋白规范工作液。留意稀释时依照10倍梯度办法稀释，确保稀释准确。

  将蛋白规范工作液别离按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理盐水顺次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL将上述梯度工作液补足到20 μL。得到蛋白浓度顺次为0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲线

  向规范曲线样品孔及待测样品孔中每孔参加BCA显色工作液200 μL，充沛混匀（可将96孔板放在振动器上振动30 s），37℃反响30 min后，以规范曲线 nm波长下比色测定，记载各孔吸光度值。（注：也能够在室温反响2 h，或60℃反响30 min。假如蛋白浓度较低，主张置于60℃反响）

  为了让我们更直观地了解小赛家BCA 蛋白定量检测试剂盒的使用办法，小赛还为我们预备了视频。

  受温度和时刻的影响较大，吸光度值会跟着时刻的延伸或温度上升而改变，若无法准确操控显色反响的时刻和温度，主张每次测定都需要做规范曲线. 在进行蛋白规范贮备液的制造时，需确保溶解充沛。稀释制造蛋白规范工作液时主张10倍梯度稀释

  3. 为确保蛋白的准确定量，样品的提取和蛋白规范品的稀释制造最好选用相同的缓冲液