【专利摘要】本发明公开了一种表达重组蛋白的发酵工艺，具体为在培养基上接种大肠杆菌，低温过夜培养，然后升温补料培养，适时诱导收获菌体。本发明的发酵工艺整一个完整的过程都是在同一个发酵罐中进行，没有过度消耗碳源，菌体生活环境保持稳定，这样在后续的发酵过程中菌体能保持很快的生长速度，效率大幅度的提升，工艺稳定性也得以增强。同时免去了种子扩大的设备需求，降低了生产成本。

  [0001]本发明涉及蛋白质医药生物工程与【技术领域】，具体涉及一种表达重组蛋白的发酵工艺。

  [0002]大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，大范围的使用在重组蛋白表达，在各大科研院所和制药企业发酵规模已超越千吨。

  [0003]然而，由于在发酵工艺上长期没有大的技术突破，目前发酵仍然停留在逐级放大菌种后再接种的模式上。由于逐级接种相当于使菌种不停地适应新环境，尤其是在某些发酵工艺中菌种扩大培养基和生产培养基成分不一致的时候更是这样。即使是成分一致，在菌种扩大过程中，由于菌体的生长消耗，也会使得培养基成分发生改变，从而与后续的接种培养基成分不一致，甚至连PH也不一致。

  [0004]很多情况下，由于菌体需要时间来适应新环境，导致菌体必须经过一个延迟期(Lag phase)。在真实的操作中，这一段时间可能是2小时，也可能是9小时，取决于菌体适应新环境的能力，每个批次可能都不一样，这就给工艺稳定性提出了挑战。

  [0005]本发明人在研究过程中发现，在发酵过程中改变传统工艺中的37 °C逐级放大培养模式，不要换掉培养基和发酵罐，能够在一个发酵罐中完成所有的发酵工艺。通过采用降低温度的办法能够有效地降低菌体的新陈代谢水平，在低温下，菌体的生长很慢，几乎要用3-5倍的时间来达到常规发酵温度下的生长状态。同时，由于葡萄糖的预先加入，菌体受制于分解代谢物阻遏，会优先利用葡萄糖，即使培养基中可能混有乳糖类的杂质，也不会产生诱导效应，在这样的条件下，菌体能够安然度过夜间的12-20小时，一旦开始升温和补加碳源，可以立即进入对数生长期进行迅速增加。该办法能够使菌体在生产培养基中进行长时间的适应，但是并不快速增殖，能够尽可能的防止菌体自身新陈代谢消耗培养基成分，同时避免菌体产生代谢废物，使得菌体的新陈代谢系统准备好。这样的一个处理就可以使菌体度过延迟期，一旦开始发酵，立即进入对数生长期(Log phase)，发酵时间将会比传统工艺短至少6-9小时，大幅度的降低了生产所带来的成本、提高了工作效率，节约了生产时间和原辅料，工艺可控，批间一致性增强，稳定性高。

  [0006]本发明要解决的技术问题就在于提供一种表达重组蛋白的发酵工艺，进而使发酵的效率大幅度的提升，工艺稳定性也得以增强。同时免去种子扩大的设备需求，降低成本。

  一种表达重组蛋白的发酵工艺，该发酵工艺在同一个发酵罐中完成，含有如下步骤: (O培养基和流加培养液的配制和灭菌；

  用纯化水分别配制浓度为5-15g/L的甘油、0.ι-lg/L的葡萄糖、5-30g/L的大豆蛋白胨、0.01-0.lg/L消泡剂、5-15g/L的十二水磷酸氢二钠、2_10g/L的磷酸二氢钾、l_5g/L的氯化铵、0.2-lg/L的硫酸钠，配制后均匀混合制得混合溶液；用5-lOmol/L氢氧化钠溶液调节该混合溶液的PH值至7.2±0.2，并于110-115°C高压蒸汽灭菌15-30分钟；灭菌完成并冷却至20-50°C后，添加已经过0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌的微量元素浓缩液至终浓度如下:七水硫酸镁200-600mg/L、二水氯化钙10_30mg/L、七水硫酸亚铁10_50mg/L、四水钥酸铵0.01-0.lmg/L、硼酸0.1-0.5mg/L、六水氯化钴0.01-0.lmg/L、五水硫酸铜

  用纯化水配制浓度为500-1000g/L的甘油，在115-121°C高压灭菌20-30分钟，冷却至室温；IPTG 1-10 mol/L,纯化水配制后经过0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌；用纯化水配制浓度为5-10mol/L的氢氧化钠；

  0.05-0.1bar，向发酵罐中按1:50，000-1: 5，000的比例接种吸光度0D600为0.2-1的冻存大肠杆菌甘油菌种，保持此发酵条件进行过夜培养。

  低温过夜培养12-20小时后，升高发酵温度至35-38°C，提高搅拌转速和通气量，维持溶氧比率于10-30%，补加甘油流加培养液，维持发酵罐中甘油浓度为5-15g/L，氢氧化钠流加培养液由发酵罐控制，将PH维持在7.2±0.2 ;

  将发酵液吸光度0D600升高至10-60时进行诱导，诱导之后4-6小时下罐，收集发酵液，离心收集菌体。

  [0012]其中，培养基中含有引起大肠杆菌分解代谢物阻遏的葡萄糖,浓度为0.3-0.7g/L。

  [0013]其中，培养基中含有作为氮源使用的大豆蛋白胨，浓度为15_25g/L。

  [0015]其中，低温下过夜培养温度为20-35°C，进一步优选为25-31°C

  其中，重组蛋白选自重组人超氧化物歧化酶或重组人碱性成纤维细胞生长因子或重组人促血小板生成素模拟肽或可溶性表达或者包涵体表达的重组蛋白中的任意一种。

  [0016]其中，所述的大肠杆菌是指肠杆菌科埃希氏菌属的埃希氏菌及其亚种。

  (3)通过夜间低温条件的驯化，使菌种非常良好地适应了发酵条件，缩短发酵延迟期，大幅度的提升了发酵时菌体生长速度，提高了发酵效率；

  (4)菌种均一化程度高，不容易出现发酵延迟的情况，工艺稳定性得到了增强；

  (5)葡萄糖的存在利用了大肠杆菌分解代谢物阻遏的生理过程，避免了本底表达；

  (7)方法简单，可操作性强，充分的利用发酵工业现有设备，易于推广和工业化大生产的需求。

  [0018]图1为在本发明涉及的发酵工艺下，发酵过程中连续三罐大肠杆菌的生长曲线。

  [0019]以下通过实施例形式的【具体实施方式】对本发明的内容作进一步的详细说明。但不应将其理解为本发明的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明的内容所实现的技术方案均属于本发明的范围。显然，根据本发明的内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明的基本技术思想的前提下，还能做出其它多种形式的修改、替换和变更。

  硫酸镁浓缩液:称取七水硫酸镁50g，纯化水定容至10ml并经过0.22 μ m过滤除菌；氯化钙浓缩液:称取二水氯化钙1.5g，纯化水定容至10ml并经过0.22 μ m过滤除菌；硫酸亚铁浓缩液:称取七水硫酸亚铁2.8g,纯化水定容至10ml并经过0.22 μ m过滤除囷；

  微量元素浓缩液:称取四水钥酸铵0.37g、硼酸2.47g、六水氯化钴0.71g、五水硫酸铜

  0.25g、一水硫酸锰1.35g、七水硫酸锌0.29g，纯化水定容至10ml并经过0.22 μ m过滤除菌。

  [0021]称取甘油225g、葡萄糖15g、大豆蛋白胨600g、Antifoam 204 lg、十二水磷酸氢二钠270g、磷酸二氢钾100g、氯化铵80g、硫酸钠21g ;纯化水配制后,用10mol/L氢氧化钠溶液调节PH值至7.2，定容至27L并于115°C下高压蒸汽灭菌20分钟。

  [0022]灭菌完成并冷却至30°C后，向培养基中添加已经过0.22 μ m过滤除菌的硫酸镁浓缩液、氯化钙浓缩液、硫酸亚铁浓缩液各30ml，添加微量元素浓缩液3ml。

  称取甘油2000g，纯化水定容至2L后在121°C高压灭菌20分钟，冷却至室温；

  取IPTG 0.1mol，纯化水定容至10ml后经过0.22 μ m过滤除菌；称取氢氧化钠400g,纯化水定容至1L。

  维持培养基温度31 °C、通气量18L/min、搅拌转速300rpm、罐压0.05bar,向发酵罐中按1:30，000的比例接种吸光度0D_为0.3的冻存大肠杆菌甘油菌种。保持此发酵条件进行过夜培养。

  低温过夜培养17小时后，0D_达到11.46，升高发酵温度至37 °C，适度提高搅拌转速和通气量，维持溶氧比率于20%，适时补加甘油流加培养液，维持发酵罐中甘油浓度为5-15g/L，氢氧化钠流加培养液由发酵罐控制，将pH维持在7.2。

  [0027]发酵液吸光度0D_升高至24.28时补加30ml IPTG进行诱导，诱导之后4小时下罐,收集发酵液,离心收集菌体。获得湿菌体总共1.6kg。

  1.一种表达重组蛋白的发酵工艺，其特征是，该发酵工艺在同一个发酵罐中完成，含有如下步骤: (1)培养基和流加培养液的配制和灭菌； (2)接种并在低温下过夜培养； (3)升温并开始补料培养； (4)诱导并收获菌体。

  2.根据权利要求1中所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺，其特征是， (O培养基的配制和灭菌过程为: 用纯化水分别配制浓度为5-15g/L的甘油、0.Ι-lg/L的葡萄糖、5-30g/L的大豆蛋白胨、0.01-0.lg/L消泡剂、5-15g/L的十二水磷酸氢二钠、2_10g/L的磷酸二氢钾、l_5g/L的氯化铵、0.2-lg/L的硫酸钠，配制后均匀混合制得混合溶液；用5-lOmol/L氢氧化钠溶液调节该混合溶液的PH值至7.2±0.2，并于110-115°C高压蒸汽灭菌15-30分钟；灭菌完成并冷却至20-50°C后，添加已经过0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌的微量元素浓缩液至终浓度如下:七水硫酸镁200-600mg/L、二水氯化钙10_30mg/L、七水硫酸亚铁10_50mg/L、四水钥酸铵0.01-0.lmg/L、硼酸0.1-0.5mg/L、六水氯化钴0.01-0.lmg/L、五水硫酸铜0.01-0.lmg/L、一水硫酸锰 0.05-0.5 mg/L、七水硫酸锌 0.01-0.lmg/L ； (2)流加培养液的配制和灭菌过程为: 用纯化水配制浓度为500-1000g/L的甘油，在115-121°C高压灭菌20-30分钟，冷却至室温；IPTG 1-10 mol/L，纯化水配制后经过0.22 μ m的微孔滤膜过滤除菌；用纯化水配制浓度为5-10mol/L的氢氧化钠； (3)接种并在低温下过夜培养的过程为: 维持培养基温度为20-35 °C、通气量为0.5-lvvm、搅拌转速为100-500rpm、罐压为0.05-0.1bar，向发酵罐中按1:50，000-1:5，000的比例接种吸光度OD600为0.2-1的冻存大肠杆菌甘油菌种，保持此发酵条件进行过夜培养； (4)升温并开始补料培养的过程为: 低温过夜培养12-20小时后，升高发酵温度至35-38°C，提高搅拌转速和通气量，维持溶氧比率于10-30%，补加甘油流加培养液，维持发酵罐中甘油浓度为5-15g/L，氢氧化钠流加培养液由发酵罐控制，将pH维持在7.2±0.2 ; (5)诱导并收获菌体的过程为: 将发酵液吸光度0D_升高至10-60时进行诱导，诱导之后4-6小时下罐，收集发酵液，离心收集菌体。

  4.根据权利要求1所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺，其特征是，所述的流加培养液的组成为500-1000g/L甘油、l-10mol/L的IPTG。

  5.根据权利要求1所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺，其特征是，所述的培养基中含有引起大肠杆菌分解代谢物阻遏的葡萄糖，浓度为0.3-0.7g/L。

  6.根据权利要求1所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺，其特征是，所述的培养基中含有作为氮源使用的大豆蛋白胨，浓度为15-25g/L。

  7.根据权利要求1所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺，其特征是，所述的消泡剂选自 Antifoam 204 (Sigma 制)或 Antifoam SI (Wako 制)或 ΤΗΙχ-298 (烟台恒鑫制)或消泡剂0061 (佛山盈智制)中的任意一种。

  8.根据权利要求1所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺，其特征是，所述的低温下过夜培养温度为20-35°C，进一步优选为25-31 °C。

  9.根据权利要求1所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺，其特征是，所述的重组蛋白选自重组人超氧化物歧化酶或重组人碱性成纤维细胞生长因子或重组人促血小板生成素模拟肽或可溶性表达或者包涵体表达的重组蛋白中的任意一种。

  10.根据权利要求1所述的一种表达重组蛋白的发酵工艺，其特征是，表达重组蛋白的菌 种为大肠杆菌，进一步为肠杆菌科埃希氏菌属的埃希氏菌及其亚种。

  【发明者】赵建多, 常翠云, 王延山, 李辰霄, 齐连权, 肖萱 申请人:北京泰德制药股份有限公司