导读：本文主要内容为常用的酵母菌表达体系，酵母菌表达的优势，常用的毕赤酵母菌菌株等。

  随着基因工程技术的加快速度进行发展，对于重组蛋白的外源表达的需求也随之水涨船高。尽管科研人员在寻找表达载体方面做出了诸多努力，但是目前主流的表达体系仍然是由大肠杆菌、酵母、昆虫细胞以及动物细胞等构成。

  大肠杆菌体系的优点是其结构相对比较简单，操作便捷，外源蛋白表达量高，大规模生产所带来的成本较低；

  其主要原因是糖基化修饰发生在内质网和高尔基体，大肠杆菌是原核生物没有细胞器自然没有内质网和高尔基体，所以表达的外源蛋白没有糖基化的修饰。

  1. 表达量过高,研究之后发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快,以至于没有足够的时间进行折叠,二硫键不能正确配对，过多蛋白间的非特异性结合,蛋白质无法达到足够的溶解度等。

  2. 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,真核糖蛋白无法糖基化使中间体溶解度下降,导致不溶解包涵体形成。

  酵母体系的优点主要是兼具原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工能力，但存在产量低及过度糖基化等问题。

  昆虫细胞的优点主要是具有高等真核生物表达系统的优点，产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，但糖基化程度较低,形式单一。

  哺乳动物细胞系统的有点主要是产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等后加工最准确,但表达水平较低。

  由于不同的表达系统在表达量、蛋白表达周期、蛋白折叠和加工能力、蛋白翻译后修饰如糖基化修饰和经济成本等方面存在一定的差异，因此就需要根据不同的重组蛋白特点以及不同应用目的来选择正真适合的表达系统。

  耀海生物深耕大肠杆菌体系多年在大肠杆菌和毕赤酵母菌表达体系的运用方面均有丰富的经验，曾多次帮助友商及客户成功解决多次项目困境并完成技术优化。如有技术升级以及实际操作问题需求，欢迎随时咨询。

  毕赤酵母表达体系是目前已知酵母体系中使用表现最好的且被普遍的应用。毕赤酵母菌表达体系不仅仅具备高稳定、高表达、高分泌的特点，而且其宿主甲醇酵母一巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)具有高密度生长的特性。甲醇酵母是可利用甲醇作为单一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、PichiaPastoris三种。其中P.Pastoris作为基因表达系统使用得最多、最广泛，己被认为是最具有发展前途的生产蛋白质的工具之一。

  毕赤酵母菌表达体系的分泌产物发酵密度较高、产物分泌效率高且能进行糖基化表达，利用强效可调控启动子A0X1，已高效表达了多种外源基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模。

  耀海生物已经成功设计并完成了多次毕赤酵母菌的发酵项目，对于毕赤酵母菌的大规模工业化发酵和获取外源分泌物有独到经验，并且已将相关经验整理成册，如有需要欢迎随时咨询。

  (1)含有AOX启动子。这是目前启动能力最强，调控机理最严格的启动子之一，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；

  (2)表达量高，既可以胞内表达，又可以分泌表达。绝大多数外源基因比在原核细胞、酿酒酵母、真核细胞中表达量高。一般毕赤酵母中外源基因都带有分泌信号肽，使外源目的蛋白分泌到培养液中，方便纯化；

  (3)发酵工艺成熟，适合高密度发酵。己经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达150g/L以上，表达重组蛋白时，已成功放大到80，000升；

  (4)使用基础盐培养基。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖；

  (5)遗传性状稳定。一般外源基因整合到巴斯德毕赤酵母染色体上，随着染色体的复制而复制，不易丢失；而且遗传背景清楚，便于遗传操作。

  (6)作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰的功能。

  随着新冠病毒的持续流行和不断变种，对于新冠病毒的治疗措施的研究也慢慢变得多，但主要依靠的还是疫苗和纳米抗体中和疗法。

  纳米抗体中和疗法主要是依靠的是纳米抗体，纳米抗体作为目前已知能与抗原结合的最小片段，分子量小且稳定，在传染病的治疗中能够最终靠呼吸道给药为疾病的治疗带来极大的方便。使用纳米抗体作为中和抗体用来治疗新冠病毒引发的新冠肺炎是目前很具有前景的治疗方法。毕赤酵母作为异源蛋白表达常用宿主，常用于生产医药蛋白。

  根据《新冠病毒中和毒性纳米抗体在毕赤酵母的高效分泌表达》，研究人员在大肠杆菌和毕赤酵母中同时表达二价纳米抗体，结果发现在毕赤酵母中表达的纳米抗体比在大肠杆菌中表达的纳米抗体具有更高的中和活性，这主要依赖的是毕赤酵母更加有助于二硫键的形成，因此导致的纳米抗体活性更高。

  耀海生物在利用毕赤酵母菌进行纳米抗体的高效表达方面有着非常丰富的实际操作经验，成功帮助客户进行双价抗体（免疫球蛋白重链）的毕赤酵母菌的高效表达其最大的作用靶点是抗新冠重链可变区抗体。耀海生物致力于打造CRO/CDMO/MAH全方位纳米抗体服务，欢迎随时咨询。

  在大规模工业化生产中毕赤酵母菌常见的问题主要是表达量不高以及表达失败的情况。

  1.产物降解：毕赤酵母表达系统常见的讲解原因是在表达蛋白的情况下，可能被自身所分泌的蛋白酶降解。随着发酵密度的不断增高，所分泌的蛋白酶也显著增高，所表达的外源蛋白也会相应的被降解。

  2.部分外源表达分泌不能：毕赤酵母表达系统可能由于自身转录机制等问题造成mRNA被切断，导致相应的外源蛋白分泌能力不足。

  ４. 发酵周期相对较长:发酵虽然能达到非常高的菌体密度，但是发酵周期一般相对原核细胞明显较长，容易被污染，且长时间的发酵也不利于外源蛋白的累积。

  ５.糖基化表达：毕赤酵母菌的糖基化表达的方式是高甘露糖型，与哺乳动物不同。

  目前主要使用的菌株均来自于原始的Y-11430菌，并以此分化出多种不同基因型的菌株，如野生型、营养缺陷和蛋白酶缺陷。

  常用的毕赤酵母宿主菌基因型和表型如下图所示，其中GS115，KM71和SMD1168含有HIS4基因突变而不能合成组氨酸，部分表达载体中含有HIS4基因作为筛选标记，转化子可以在组氨酸缺陷型培养基中生长。另外GS115，X33，和SMD系列菌株含有野生型的A0X1基因，高达85%的甲醇利用率是由该基因完成的，转化子通常产生Mut+甲醇利用表型；而KM71和KM71H的A0X1由于基因突变，异常的代谢甲醇，甲醇氧化酶A0X2开始负责代谢甲醇，但是这个酶的启动子非常弱，该酶A0X2的表达量较低，甲醇利用速度较慢，转化子通常产生Muts表型。Mut+甲醇利用表型的转化子能够迅速代谢甲醇，因此在甲醇培养基中能够迅速生长，诱导表达时需要消耗大量甲醇，而Muts表型转化子代谢甲醇能力很弱，诱导表达时需要的甲醇量很少。因此他们各有缺点，尽管多数人倾向于使用Muts菌株，但是有时候Muts菌株也可能获得更髙的表达水平。SMD系列菌株是胞外蛋白水解酶缺陷型菌株，在使用非复合培养基时通常能够更好的降低分泌蛋白产物的降解。

  [1]段烨红.新冠病毒中和毒性纳米抗体在毕赤酵母的高效分泌表达[D].华南理工大学.2021.